A microfluídica de afinidade permite alta

Communications Biology volume 5, Número do artigo: 1147 (2022) Citar este artigo

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A degradação de proteínas mediada pela via ubiquitina-proteassoma regula eventos de sinalização em muitas condições fisiológicas e patológicas. Ensaios de degradação in vitro têm sido fundamentais para a compreensão de como a proliferação celular e outros processos celulares fundamentais são regulados. Esses ensaios são diretos, específicos no tempo e altamente informativos, mas também trabalhosos, geralmente baseados em eletroforese em gel de poliacrilamida de baixo rendimento, seguida de autorradiografia ou imunoblotting. Apresentamos a degradação de proteínas no chip (pDOC), uma tecnologia microfluídica integrada baseada em MITOMI para descoberta e análise da degradação de proteínas em extratos livres de células. A plataforma acomoda centenas de microcâmaras nas quais a degradação de proteínas é analisada rapidamente, simultaneamente e usando quantidades mínimas de reagentes em um ou mais ambientes físico-químicos. Essencialmente, o pDOC fornece uma alternativa multiplex sensível ao ensaio de degradação convencional, com relevância para a pesquisa biomédica e translacional associada à proteólise regulada.

A degradação de proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma é um módulo regulador central através do qual o nível de proteínas em todas as células eucarióticas permanece equilibrado. O desvio da quantidade desejada de cada proteína em um determinado momento pode ser prejudicial para a célula, levando a tecidos disfuncionais e uma ampla gama de doenças em humanos, incluindo câncer, fibrose cística e distúrbios neurodegenerativos1,2.

A cascata central subjacente à ubiquitinação envolve três enzimas: A enzima E1 liga-se covalentemente e ativa a molécula de ubiquitina para transferência para uma enzima conjugadora de E2. Em seguida, o E2 conjugado com ubiquitina interage com uma enzima E3 ubiquitina-ligase, que catalisa a transferência de moléculas de ubiquitina do E2 para a proteína alvo, tipicamente por meio de uma ligação isopeptídica a um resíduo de lisina. Eventos de ubiquitinação repetitivos podem formar uma ou mais cadeias de porções de ubiquitina na proteína alvo (ou seja, poliubiquitinação). Uma cadeia de poliubiquitina reconhecida pelo proteassoma desencadeia a degradação da proteína1,2. Centenas de diferentes enzimas E3 governam o enorme alcance funcional e a especificidade de todo o processo de ubiquitinação. No que diz respeito à proliferação celular e regulação do ciclo celular, o complexo promotor de anáfase/ciclossoma (APC/C) e o complexo proteico Skp1-Cullin-F-box (SCF) são particularmente importantes3,4,5. A especificidade do substrato de ambos os complexos depende de coativadores: Cdc20 e Cdh1 para o APC/C e uma das várias proteínas F-box para o SCF, por exemplo, Skp2 e β-TrCP6,7,8. No geral, a proteólise ordenada mediada por enzimas E3 reguladas pelo ciclo celular garante o ciclo celular unidirecional em todos os eucariotos6,7,8,9,10.

Enquanto algumas formas de cadeias de ubiquitina marcam proteínas para degradação pelo proteassoma, a monoubiquitinação e outras formas de poliubiquitinação regulam as cascatas de sinalização por vias independentes do proteassoma11. Além disso, a ubiquitinação pode ser revertida por enzimas chamadas deubiquitinases de uma maneira que pode impedir a proteólise12. Por outro lado, a degradação proteassômica nem sempre pode ser acoplada à ubiquitinação13. Assim, a degradação de proteínas não pode ser inferida a partir da ubiquitinação e deve ser determinada diretamente.

Ensaios de degradação de proteínas em extratos livres de células, também conhecidos como 'sistemas livres de células', têm sido fundamentais na pesquisa de biologia celular, permitindo análises diretas e quantitativas da proteólise mediada por ubiquitina em ambientes fisiologicamente relevantes. De fato, muitos dos princípios do ciclo celular foram descobertos monitorando a degradação das proteínas do ciclo celular em extratos de ovos de rã ou ciclando células humanas (ver, por exemplo, 14,15,16,17,18,19,20). O uso extensivo desses 'ensaios de degradação' na era moderna de hoje é uma prova de sua eficácia (ver, por exemplo, 21,22,23). Curiosamente, os ensaios de degradação convencionais nunca se beneficiaram verdadeiramente das tecnologias modernas e ainda dependem de eletroforese em gel, autorradiografia ou imunotransferência e grande quantidade de material biológico.