Perfil de proteína de superfície da próstata

Biologia das Comunicações volume 5, Número do artigo: 1402 (2022) Citar este artigo

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As vesículas extracelulares (EVs) são mediadores da comunicação intercelular e uma classe promissora de biomarcadores. As proteínas de superfície de EVs desempenham papéis decisivos no estabelecimento de uma conexão com as células receptoras e são alvos putativos para ensaios de diagnóstico. A análise das proteínas de superfície pode iluminar as funções biológicas dos EVs e ajudar a identificar potenciais biomarcadores. Desenvolvemos uma estratégia combinando espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) e ensaios de ligação de proximidade (PLA) para primeiro identificar e depois validar proteínas de superfície descobertas em EVs. Aplicamos nosso fluxo de trabalho para investigar proteínas de superfície de pequenas EVs encontradas no fluido seminal (SF-sEV). Identificamos 1.014 proteínas de superfície e verificamos a presença de um subconjunto destas na superfície dos SF-sEVs. Nosso trabalho demonstra uma estratégia geral para análise profunda das proteínas de superfície de EVs em pacientes e condições patológicas, procedendo de triagem imparcial por HRMS a análises direcionadas ultrassensíveis via PLA.

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas lipídicas bicamadas secretadas pela maioria das células. Existem três subgrupos principais de EVs, que são classificados de acordo com seus tamanhos, biogênese e densidade: (i) exossomos, (ii) microvesículas e (iii) corpos apoptóticos. Os exossomos são pequenos EVs (sEVs) com tamanho variando entre 30 e 150 nm, que são gerados pelo brotamento interno de endossomos, que levam à produção de corpos multivesiculares (MVBs). Os MVBs finalmente se fundem com a membrana plasmática e liberam seu conteúdo sEV na matriz extracelular, bem como nos fluidos corporais, onde os sEVs demonstraram desempenhar papéis críticos na comunicação intercelular1,2,3,4,5. Microvesículas com tamanho variando de 100 a 800 nm e corpos apoptóticos com tamanho variando de 200 nm a 5 μm são eliminadas diretamente das membranas plasmáticas de células viáveis ​​e daquelas que sofrem morte celular programada, respectivamente6. sEVs, bem como microvesículas e corpos apoptóticos podem mediar o transporte intercelular para a entrega de cargas moleculares contendo proteínas, lipídios, pequenos RNAs e outras espécies de RNA e fragmentos de DNA genômico1,7,8.

Estudos recentes demonstraram que o conteúdo de EVs difere dependendo de sua linhagem celular e que, assim, refletem as células de onde se originam. A análise da variação dinâmica das impressões digitais do sEV pode fornecer um meio valioso para rastrear e monitorar doenças9,10,11,12,13. Estudos e ensaios moleculares atuais focados em biomarcadores circulantes avaliam principalmente o conteúdo de RNA e lipídios de sEVs circulantes, mas há um interesse crescente também em investigar a composição proteica de sEVs3. Em particular, as proteínas de superfície de EVs são de grande interesse devido ao seu papel no estabelecimento de contato com as células-alvo, o que pode levar à sua captação celular ou fusão com a membrana plasmática antes da liberação de suas cargas moleculares14.

Os sEVs do fluido seminal (SF-sEV), também conhecidos como prostassomas, são secretados pela próstata no fluido seminal, onde uma de suas principais funções é interagir diretamente e proteger as células espermáticas15,16,17. A fusão dos SF-sEVs com a membrana plasmática do espermatozóide é necessária para a regulação de diferentes aspectos da função espermática, como motilidade e capacitação, uma das últimas etapas na maturação dos espermatozóides necessária para adquirir capacidade de fertilização18,19. SF-sEVs também foram implicados na interação entre células de câncer prostático e seu microambiente20. Eles são reconhecidos como potenciais biomarcadores na infertilidade masculina21 e no câncer de próstata22,23, mas pouco se sabe sobre os mecanismos celulares que levam à sua produção e as vias moleculares que conduzem as funções do SF-sEV.

A análise de proteínas baseada em espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta eficiente e amplamente utilizada para caracterizar as proteínas EVs24,25. Os dados gerados pelo MS contribuíram para o desenvolvimento de bancos de dados online, como ExoCarta (www.exocarta.org)26 e Vesiclepedia (www.microvesicles.org), que listam proteínas encontradas em VEs, incluindo sEVs27. Várias técnicas bioquímicas têm sido aplicadas para análise baseada em MS de proteínas de membrana com baixa abundância em EVs28. Em particular, reagentes não permeáveis ​​à membrana para derivatização química, como sulfo-NHS-SS-biotina, foram implementados para estudar proteínas de superfície celular29 e proteínas de superfície EV de células de câncer pancreático30 e a linhagem de mastócitos HMC-131.